14次 摘要：目的:探讨新型载盐酸四环素根尖充填材料 (NRFM-THC) 制备、理化性能、细胞相容性及其对粪肠球菌的抑制作用.方法:在新型根尖充填材料中添加质量分数为1%盐酸四环素制备NRFM-THC;采用傅立叶红外光谱、X-射线衍射对其表征, 并检测其固化时间、抗压强度、 --> 　　摘要：目的:探讨新型载盐酸四环素根尖充填材料 (NRFM-THC) 制备、理化性能、细胞相容性及其对粪肠球菌的抑制作用.方法:在新型根尖充填材料中添加质量分数为1%盐酸四环素制备NRFM-THC;采用傅立叶红外光谱、X-射线衍射对其表征, 并检测其固化时间、抗压强度、抗稀散性和X射线阻射性能;MTT比色法检测其细胞相容性;琼脂糖扩散法及直接接触法检测其对粪肠球菌的抑制作用.结果:NRFM-THC主要成分为羟基磷灰石、羧酸钙盐及氧化锆, 固化时间为 (11.7±0.6) min, 固化1 d及7 d组抗压强度分别为 (43.9±4.5) MPa及 (69.6±13.5) MPa, X射线阻射值等效于 (3.6±0.2) mm纯铝, 抗稀散性能良好等;细胞毒性分级为0级或Ⅰ级, 符合GB/T 16886.5—2003标准;对粪肠球菌有抑制作用.结论:NRFM-THC具有良好的理化性能、细胞相容性及抑制粪肠球菌性能.　　关键词：根尖充填材料; 盐酸四环素; 理化性能; 细胞相容性; 粪肠球菌;　　临床使用的根尖充填材料种类众多, 性能各异, 但大部分根尖充填材料的封闭性能不理想[1-5].残存于根管系统内的微生物及其代谢物通过根尖充填材料与牙体组织之间的微小间隙进入根尖周组织, 引起再次感染, 甚至造成根管外科手术的失败.因此, 理想的根尖充填材料应具有一定的抑菌作用[5-7].　　本项目前期研究中[8-9]采用羟基磷灰石、磷酸四钙、聚丙烯酸及氧化锆等材料进行复合, 研制出一种具有良好的理化性能及细胞相容性的新型根尖充填材料 (novel root-end filling material, NRFM) , 但由于不含抑菌成分, 因而不具备抑菌性能.NRFM主要成分之一的羟基磷灰石除具有良好的生物活性及生物相容性外, 还具有良好的吸附性能, 可作为四环素类等多种抑菌药物载体, 提高其抑菌性能.Madhumathi等[10]研究显示载有四环素的钙亏羟基磷灰石纳米载体对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌具有抑制作用.四环素是一类对革兰氏阳性菌、阴性菌及螺旋体属等有良好抑制作用的广谱抗菌素, 对粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、牙髓卟啉菌、放线菌等常见的根管内的感染微生物有抑制作用外[10-13];还能减轻根尖周组织感染、防止骨组织吸收及促进骨组织的生成作用等[14-17].故本研究以NRFM为载体, 载入质量分数为1%的盐酸四环素 (tetracycline hydrochloride, THC) , 制备出新型载盐酸四环素根尖充填材料 (novel root-end filling material containing tetracycline hydrochloride, NRFM-THC) , 并对其理化性能、细胞相容性及其对感染根管内常见微生物粪肠球菌的抑制作用进行研究, 为临床应用提供实验依据.　　1 材料和方法　　1.1 材料　　NRFM粉剂 (按质量分数分别为34.8%羟基磷灰石、34.8%磷酸四钙、7%聚丙烯酸、1.7%柠檬酸、1.7%柠檬酸钠及20%氧化锆混合) 由东南大学生物电子学国家重点实验室研制;THC购自美国MedChemexpress生物科技公司;三氧化矿物凝聚体 (mineral trioxide aggregate, MTA) 购自美国Dentsply公司;FX-II型玻璃离子水门汀 (glass ionomer cement, GIC) 购自日本Shofu公司;小鼠结缔组织成纤维细胞L929细胞购自中科院上海细胞研究所;ATCC 29212粪肠球菌购自东南大学附属中大医院检验科;THC药敏纸片购自英国Oxoid公司;D8-advance型X射线衍射仪 (X-ray diffraction, XRD) 为德国Bruker公司产品;Nicolet 5700型傅立叶红外光谱仪 (Fourier transform infrared spectrometer, FTIR) 为美国Nicolet公司产品;万能材料试验机为深圳新三思材料检测有限公司产品;微型扫描仪 (Dürr Dental VistaScan Mini Image Plate Scanner) 为德国Dürr Dental公司产品.　　1.2 方法　　1.2.1 NRFM-THC制备　　取NRFM粉剂和THC粉剂按mNFFM ∶mTHC=99 ∶1, 充分研磨后, 过200目筛, 制备成NRFM-THC粉剂, 隔湿避光保存、备用;以蒸馏水为液剂, 将粉剂和液剂按m粉剂 ∶m液剂=5 ∶1进行调拌.　　1.2.2 NRFM-THC等材料表征　　将固化1周的NRFM及NRFM-THC样品材料研磨成粉, 采用D8-advance型X射线衍射仪进行样品表面结构分析, CuKα辐射, 扫描范围20°～50°;采用Nicolet 5 700型傅立叶红外光谱仪对THC、NRFM及NRFM-THC等材料进行红外光谱测试, 扫描范围为400～4 000 cm-1[8-9].　　1.2.3 固化时间及抗压强度　　将NRFM及NRFM-THC按粉液质量比5 ∶1调拌后, 立即置入直径为10 mm、高为2 mm的模具内, 采用维卡氏针 (针质量为300 g、直径为1 mm) 法测量其固化时间[8-9];将NRFM-THC等样品材料制备成高度6 mm、直径4 mm的圆柱形样品, 采用万能材料试验机测量其抗压强度, 即轴向加压, 加载速度是1 mm/min, 记录压力-形变的曲线变化等[8-9,18].　　1.2.4 抗稀散性能　　取NRFM、NRFM-THC样品材料各0.5 g, 按粉液质量比5 ∶1调拌均匀后, 制备成球状, 并立即置于加有pH=7.4的磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer saline, PBS) 的6孔培养板内, 静置10 min后, 观察样品材料的抗稀散性能[8-9].　　1.2.5 X线阻射性能　　按照ISO 6876 (2001) 牙根管充填材料中推荐的方法[8-9,19], 将NRFM-THC等样品材料制备成直径为10 mm、高为1 mm的圆片状样品, 37℃、体积分数为100%湿度下固化24 h.同时采用直径为10 mm、高为1 mm人离体牙的牙本质块作为对照组材料;铝梯1～10 mm, 每个阶梯增加1 mm作为参照材料.将上述样品材料置于X射线数码牙片 (image plate) 表面, FT-H直流数字高频牙科X线机摄片电压为70 kV、电流为7 mA, 曝光时间为0.25 s, 曝光距离为30 cm, 将曝光后的数码牙片经微型扫描仪处理后, 采用其自带DBSWIN 5.2.0软件计算样品材料的灰度值.采用式 (1) 计算出样品材料的X线阻射值即相当于铝梯的厚度:　　X射线阻射值=A−B1B2−B1+B1所对应的铝梯厚度 (mm) (1)　　其中A表示样品材料的灰度值, B1、B2分别表示所检测样品材料灰度值之间相邻的铝梯灰度值, B2较B1厚1 mm.　　1.2.6 NRFM-THC的细胞相容性检测　　(1) NRFM-THC浸提液制备　　将NRFM-THC制备成直径5 mm、高2 mm片状样品, 体积分数为100%湿度下固化24 h, 经高温高压灭菌30 min后, 备用.按ISO 10993-12 (2007) 标准[20]进行样品材料的浸提液制备, 即样品表面积/浸提介质=1.25 cm2/mL, 37 ℃、体积分数为5%CO2下浸提72 h, 得到质量分数为100%的NRFM-THC浸提液.　　(2) 四甲基偶氮唑盐 (MTT) 比色法细胞毒性实验　　取对数增殖期的L929细胞悬液, 以每孔6.00×103个细胞接种于96孔培养板, 常规条件下培养24 h, 弃培养液, 加入不同浓度实验组浸提液 (体积分数分别为100%、50%、25%、12.5%) 、空白 (质量分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养液) 及阳性对照组 (含质量分数为0.7%丙烯酰胺单体的培养液) 各200 μL.在体积分数为5%CO2, 37 ℃条件下分别培养24、48、72 h, 采用MTT比色法进行细胞相容性研究, 即在各材料组分别滴加质量浓度为5 g/L的MTT溶液20 μL/孔, 孵育4 h, 弃培养液, 滴加二甲亚砜150 μL/孔, 震荡10 min, 在酶标仪上492 nm下测定其光密度值 (optical density, D值) , 根据式 (2) 计算出细胞相对增值率 (relative growth rate, RGR) , 按6级毒性分级法评定材料的细胞毒性程度[21-22].　　1.2.7 NRFM-THC抑制粪肠球菌实验　　(1) 样品准备　　NRFM、NRFM-THC、MTA (粉液质量比为3.3 ∶1) 及GIC (粉液质量比为2.6 ∶1) 等4种材料按其说明书进行调拌后置入硅橡胶模具内, 并用玻璃板压平, 制备出直径为6 mm、高1 mm的片状样品, 体积分数为100%湿度下固化24 h.MTA及GIC是口腔临床上常用的两种根尖充填材料, 其中MTA因具有良好的生物相容性及抑菌性能而日益受到关注, 而聚丙烯酸是GIC的主要成分之一, 因此, 本研究将其作为NRFM-THC抑菌性能研究对照组材料[1,8-9,24].　　(2) 琼脂扩散抑菌实验　　取0.5个麦氏单位 (菌液为1.5×108 CFU/mL) 的实验菌株粪肠球菌 (ATCC 29212) 液50 μL滴于MH琼脂培养基表面, 用无菌棉拭子将菌液均匀涂布至整个培养基表面.分别将固化24 h的NRFM、NRFM-THC、MTA及GIC等4种材料组、阳性对照组 (THC药敏纸片) 及阴性对照组 (生理盐水纸片) 置于实验菌的培养基表面上, 室温下放置2 h后, 再将培养皿37 ℃恒温箱内培养24 h后, 用游标卡尺测得抑菌环直径[25-26].　　(3) 直接接触法抑菌实验　　将消毒的NRFM、NRFM-THC、MTA及GIC等4个实验组、阳性对照组及阴性对照组各50 mg粉剂置于96孔板中, 取0.5个麦氏单位的实验菌株粪肠球菌液50 μL滴加在样品材料表面, 使菌体与样品材料充分接触1 h后, 添加450 μL肉汤培养液, 取出10 μL样品液体在培养板上进行接种, 24 h后计算菌落数[25].　　1.3 统计学分析　　计量资料以(x¯±s)表示, 采用SPSS 13.0统计分析软件进行单因素方差分析 (ANOVA和LSD-t检验) , P<0.05表示有统计学差异.　　2 结果　　2.1 材料表征　　2.1.1 FTIR表征　　与NRFM相似, NRFM-THC出现磷酸根 (1 090 cm-1, 1 050 cm-1, 602 cm-1及571 cm-1) 、羟基 (3 570 cm-1及631 cm-1) 、碳酸根 (1 460 cm-1及1 410 cm-1) 及羧酸根 (1 570 cm-1) 等特征峰 (图1) .　　2.1.2 XRD表征　　固化1周的NRFM与NRFM-THC样品材料的XRD谱图基本相一致, 均出现羟基磷灰石、磷酸四钙及氧化锆的特征峰.　　图1 THC、NRFM和NRFM-THC的FTIR表征　　　　Fig.1 FTIR spectra of tetracycline hydrochloride (THC) , novel root-end filling material (NRFM) and novel root-end filling materials containing tetracycline hydrochloride (NRFM-THC)　　图2 NRFM-THC的X线衍射图谱　　　　Fig.2 X-ray diffraction (XRD) patterns of NRFM-THC　　HA:羟基磷灰石, TTCP:磷酸四钙, ZrO2:氧化锆.　　2.2 固化时间及抗压强度　　NRFM-THC的固化时间为 (11.7±0.6) min, 与NRFM的固化时间 (11.8±0.9) min差别无统计学差异 (P>0.05) .固化1 d组的NRFM-THC抗压强度达到 (43.9±4.5) MPa, 显著大于NRFM (25.4±2.8) MPa (P<0.01) ;固化7 d组NRFM-THC的抗压强度 (69.6±13.5) MPa与NRFM (62.2±8.9) MPa相似, 无统计学差异 (P>0.05) .　　2.3 抗稀散性能　　NRFM及NRFM-THC在磷酸盐缓冲液中静置10 min后, 仍然呈球状, 周围无碎屑、无崩解现象, 提示两者均具有良好的抗稀散性能 (图3) .　　图3 NRFM-THC的抗稀散性　　　　Fig.3 Washout resistance test of NRFM-THC　　2.4 X射线阻射性能　　NRFM及NRFM-THC的X射线阻射值均等效于 (3.6±0.2) mm纯铝 (图4) , 显著大于牙本质的X射线阻射值 (1.3±0.1) mm (P<0.01) .　　2.5 细胞相容性　　MTT比色法检测研究结果 (表1) 显示:NRFM-THC的细胞相对增值率 (RGR) 在90.4%～107.9%之间, 细胞毒性均为0～Ⅰ级, 符合GB/T 16886.5—2003标准;其中, 24 h组的质量分数为25%NRFM-THC浸提液的细胞RGR显著高于阴性对照组、48 h组的质量分数为50%、100%的NRFM-THC浸提液的细胞RGR显著低于阴性对照组外 (P<0.05) , 其余各实验组与阴性组相比较, 均无统计学差异 (P>0.05) .　　图4 NRFM-THC的X射线阻射图像　　　　Fig.4 Radiopacity image of NRFM-THC　　A:牙本质;B:NRFM;C:NRFM-THC;D:铝梯.　　表1 MTT比色法检测NRFM-THC对L929细胞相对增值率及毒性级别的影响　　　　　Compared with negative control group, 1) P<0.05, 2) P<0.01.　　2.6 抑制粪肠球菌性能　　琼脂扩散抑菌实验显示, 与阳性对照组 (抑菌环为 (12.05±0.57) mm相似, NRFM-THC的抑菌环为 (12.67±0.58) mm (P>0.05) , NRFM、MTA、GIC及阴性对照组无抑菌环形成 (图5) .　　直接接触抑菌实验, 经过24 h培养, MTA组对粪肠球菌的抑制作用最强 (P<0.01) , 无菌落在琼脂糖凝胶上生长;阳性对照组及NRFM-THC实验组对粪肠球菌有一定的抑制作用, 其抑菌性能大于GIC、NRFM组与阴性对照组, 差别有显著性意义 (P<0.01) ;GIC、NRFM组与阴性对照组一致, 对粪肠球菌无抑制作用 (图6) .　　图5 琼脂糖扩散法NRFM-THC对粪肠球菌的抑制活性　　　　Fig.5 Antibacterial activity of NRFM-THC against Enterococcus faecalis in agar diffusion test　　A:阴性组;B:MTA;C:NRFM;D:NRFM-THC; E: GIC; F:阳性组.　　图6 直接接触法NRFM-THC测定对粪肠球菌的抑制活性　　　　Fig.6 Autibacterial activity of NRFM-THC against Enterococcus faecalis in direct contact test　　1) 与2) 相比较, 1) 与3) 相比较, 2) 与3) 相比较, P<0.01.　　3 讨论　　琼脂扩散抑菌实验是体外评价根尖材料抑菌作用应用最广泛的方法之一, 其操作简单、灵活, 可直接比较不同材料抗菌性能的差异, 但实验结果往往会受到材料溶解性及扩散性能的影响[25-26].直接接触抑菌实验是将检测材料与受试微生物直接接触, 材料的抑菌性能不受其溶解性及扩散性影响, 结果更加准确, 更适合于检测不溶材料的抑菌性能[25].Nawal等[27]认为应该采用两种或两种以上的抑菌方法检测新材料的抑菌性能.本研究采用两种方法对新型材料进行研究, 琼脂扩散抑菌实验结果显示NRFM-THC的抑菌环为 (12.67±0.58) mm, 而NRFM无抑菌环形成, 说明在NRFM中添加质量分数为1%THC能显著改善其对粪肠球菌的抑制作用;直接接触抑菌实验结果也显示NRFM-THC实验组对粪肠球菌的抑制作用大于GIC、NRFM及阴性对照组, 说明NRFM-THC可对其表面直接接触的粪肠球菌产生抑制作用, 提示充填于牙根尖洞形内的NRFM-THC不但可以抑制直接接触的粪肠球菌, 而且可能会扩散到湿润的根管系统内, 对残存于根管壁、侧副根管等根管系统内残存的粪肠球菌产生一定的抑制作用.本研究MTA组在琼脂扩散实验无抑菌环形成, 这可能与其溶解度小, 钙离子、氢氧根离子并不能在琼脂凝胶中有效释出相关;但其在直接接触抑菌实验中显示对粪肠球菌有较强的抑制作用, 这可能与MTA的强碱性相关[25-26].Morgental等[25]采用琼脂扩散抑菌实验结果也显示MTA对粪肠球无明显作用.GIC因含氟对变形链球菌等致龋菌有抑制作用, 但对粪肠球菌无抑制作用, Bhavana等[24]研究显示GIC对变形链球菌的抑制作用要显著大于粪肠球菌抑菌, 本研究结果与上述一致.　　NRFM-THC能显著提高其抑制粪肠球菌性能, 但不会对其固化反应产生显著影响[8-9].材料的FTIR表征出现磷酸根、羟基及羧酸根等特征峰, 说明其主要成分为羟基磷灰石及羧酸钙盐;XRD表征显示NRFM及NRFM-THC的谱图基本相一致, 均出现了羟基磷灰石、磷酸四钙及氧化锆的特征峰[9], 因此, 在NRFM添加THC不会改变羧酸钙盐、羟基磷灰石等酸碱中和反应产物的生成.宋志国等[28]研究显示在α-TCP骨水泥加入盐酸四环素不会阻碍水化反应的进行.　　理想的根尖充填材料的固化时间一般以5～20 min为宜, 以便于根尖倒充填手术的顺利进行.固化时间过短, 临床医师没有足够的时间进行根尖充填材料的充填;固化时间过长, 则可能要增加患者复诊次数, 且可造成未固化充填材料的异位.NRFM-THC的固化时间为 (11.7±0.6) min, 达到根管外科手术要求, 显著优于MTA (固化时间为2.5～4.0 h) 及GIC (固化时间为3.5～5.5 min) 等根尖充填材料[8-9,18].　　固化1 d组的NRFM-THC抗压强度为 (43.9±4.5) MPa, 显著大于NRFM (P<0.01) , 但固化7 d组的抗压强度无差别, 说明在NRFM添加质量分数为1%THC仅能显著提高NRFM-THC固化早期的机械性能.可能由于THC是一种螯合剂, 可以与材料中的Ca2+产生稳定的螯合, 吸附和结合到磷酸钙盐的表面[29], 提高了NRFM-THC抗压强度.在α-TCP骨水泥添加质量分数小于1%的盐酸四环素能提高其抗压强度, 但随着THC含量的增加, 其抗压强度降低[28].Ratier等[30]研究显示在注射型磷酸钙骨水泥中添加质量分数为7%的盐酸四环素会降低其抗压强度、延迟水化反应及延长固化时间等.　　与NRFM相似, NRFM-THC可在PBS液中能保持稳定、固化、且不会崩解, 因而具有良好的抗稀散性能, 特别适合于出血、组织液渗出等潮湿不利的根管外科手术环境, 可避免未固化NRFM-THC被血液、组织液及唾液冲走、异位等问题, 确保了材料的稳定性能.另外NRFM-THC的X射线阻射值为 (3.6±0.2) mm, 达到2001年ISO 6876标准中关于根尖充填材料的X射线阻射值的要求[19]应不低于3 mm厚的纯铝的要求.在X线片上, 将NRFM-THC与周围的牙本质、牙槽骨等硬组织相鉴别.　　由于根尖充填材料是一类植入牙体组织内、与根尖周组织直接接触的生物材料, 良好的生物相容性是理想根尖充填材料必须具备的性能之一.而细胞毒性试验具有周期短、敏感性强、易标准化、能定量分析等显著优点, 是口腔生物医学材料生物安全性评价体系中最重要的检测指标之一.本研究结果显示NRFM-THC的细胞相对增值率在90.4%～107.9%之间, 细胞毒性为0～Ⅰ级, 符合GB/T 16886.5—2003标准, 说明NRFM-THC具有良好的细胞相容性, NRFM具有良好的细胞相容性, 而在NRFM中添加质量分数为1%盐酸四环素不会对其细胞相容性产生显著不利的影响.Dashti等[31]研究亦显示吸附盐酸四环素的主要成分为羟基磷灰石的Bio-Oss骨移植材料细胞相容性良好.　　本研究表明NRFM-THC具有良好的理化性能及细胞相容性, 对粪肠球菌具有一定的抑制作用, THC的添加并不会改变其理化反应及其相关产物的生成, 但材料的封闭性能、成骨诱导性能等还有待于进一步研究.　　参考文献　　[1] NABEEL M, TAWFIK H M, ABU-SEIDA A M A, et al.Sealing ability of biodentine versus proroot mineral trioxide aggregate as root-end filling materials[J].Saudi Dent J, 2019, 31 (1) :16-22.　　[2] KOLLMUSS M, PREIS C E, KIST S, et al.Differences in physical characteristics and sealing ability of three tricalcium silicate-based cements used as root-end-filling materials[J].Am J Dent, 2017, 30 (4) :185-189.　　[3] SAXENA P, GUPTA S K, NEWASKAR V.Biocompatibility of root-end filling materials:recent update[J].Restor Dent Endod, 2013, 38 (3) :119-127.　　[4] SOLANKI N P, VENKAPPA K K, SHAH N C.Biocompatibility and sealing ability of mineral trioxide aggregate and biodentine as root-end filling material:A systematic review[J].J Conserv Dent, 2018, 21 (1) :10-15.　　[5] TORABINEJAD M, PARIROKH M.Mineral trioxide aggregate:a comprehensive literature review-part II:leakage and biocompatibility investigations[J].J Endod, 2010, 36 (2) 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