实时荧光定量pcr技术于1996年由美国applied biosystems推出,该技术不仅实现了pcr从定性到定量的飞跃,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点[1]。目前,该技术已广泛应用于分子生物学、医学等学科和基础研究领域,特别是在现代农业转基因作物的定性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中发挥着重要作用[2]。
荧光定量pcr技术是在pcr反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个pcr进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[3]。由于常规pcr无法对扩增反应进行实时检测,需借助凝胶电泳等手段对扩增终产物进行定性和半定量分析,不仅费时、费事、易污染,且无法对起始模板准确定量。荧光定量pcr技术是在反应体系中加入荧光基团,荧光基团发出的荧光信号随着反应进程而变化,每经过一个pcr循环反应,定量pcr仪收集1个荧光强度信号,通过荧光强度变化检测产物量的变化,从而得到1条荧光扩增曲线,荧光扩增曲线一般由基线、指数扩增期和平台期组成[4]。只有在荧光信号指数扩增阶段,pcr产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存性对应关系,才可以在这个阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较,在荧光定量pcr 反应的指数期,需要设定1个荧光信号的阈值(threshold)。荧光阈值是荧光扩增曲线上人为设定的一个值,荧光阈值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,用它可以定义样本的循环阈值(cycle threshold,ct)。ct值是pcr扩增过程中,反应管的荧光信号达到设定阈值时的循环次数。可见,ct值取决于阈值。经数学证明[5],每个模板起始拷贝数的对数与ct值存性关系。起始拷贝数越多,ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,只要获得未知样品的ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数[6]。
荧光定量pcr所使用的荧光化学材料可分为两大类,即荧光染料和荧光探针。荧光染料以sybr greenⅰ为主要代表,是非特异性荧光化学材料。荧光探针包括taqman、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等,属于特异性荧光材料。
sybr greenⅰ是一种能够与双链dna小沟结合的染料。在游离状态下,sybr greenⅰ发出微弱的荧光,但是一旦与双链dna结合,其荧光强度大大增强。因此,一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链dna量成正比,可以根据荧光信号检测出pcr体系中的双链dna的数量[7]。其优点是检测方法简单,通用性好,价格相对较低,是许多实验室开展荧光定量实验的首选。sybr greenⅰ的缺点在于它能够和所有的双链dna相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构、非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的准确性。但可以通过优化pcr的反应条件、选择设计良好的引物,来减少或去除引物二聚体和非特异性产物的产生;另外,也可以通过对扩增产物的溶解曲线进行分析来判断荧光信号的线 taqman探针
taqman探针技术是有美国perkin elmer(pe)研制的一种实时pcr定量技术,在pcr扩增加入一对引物的同时加入1个特异性的荧光探针,此荧光探针为一个30~45 bp的寡核苷酸,它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对,其5′端标记荧光发射基团,3′端标记荧光淬灭基团。当探针保持完整时,3′端淬灭基团抑制了5′端发射基团的荧光发射。但在pcr扩增中,模板变性后低温退火,引物与探针同时与模板结合,在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,taq dna聚合酶的5′→3′外切酶活性将探针5′端连接的荧光发射基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号。由于被释放的荧光基团数目和pcr 产物数量是相对应关系,且荧光强度同被释放的荧光基团的数目也是正比关系,因此该技术可对模板进行准确定量[8]。taqman探针技术特异性好、准确性高、假阳性低、重复性比较好。但是需要设计特异性的探针,因此成本较高[9]。
分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环状双标记寡核苷酸探针,环部与靶dna序列互补,为15~35 bp;茎部是由互相配对的碱基组成,但与靶dna无序列同源性,约8 bp。在探针的5′端和3′端分别标记荧光发射基团和荧光淬灭基团。当溶液中的模板与分子信标结合配对时,分子信标的构象改变成链状使得荧光发射基团与淬灭基团分开,当荧光基团被激发时,就发出荧光信号。与探针互补的靶分子数量越多,荧光信号也就越强,从而实现了对目的基因的定量检测。分子信标的方法优点是特异性强,荧光背景低。其缺点是设计困难,杂交探针不能完全与模板结合,稳定性较差,价格高[10]。
用一系列已知浓度的标准品,作为模板进行pcr反应,以标准品浓度的对数值为横坐标,以测得的ct值为纵坐标,绘制标准曲线,在相同条件下检测未知样品的ct值,从而根据标准曲线计算出未知样品的浓度(拷贝数)。制作1个好的标准曲线对定量结果至关重要,在制作标准曲线个稀释度的标准品,涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围,最好与目的基因有较高的同源性;绝对定量标准品通常可以是纯化的质粒dsdna,体外转录的rna,或者是体外合成的ssdna、标准品的量可根据260 nm的吸光度值并用dna或rna的分子量转换成其拷贝数来确定。
在某些不需要对基因进行绝对定量、只需要确定基因相对表达差异的情况下,如某基因在经过某种处理后表达量是增加了还是减少了,用相对定量的方法就可以得到结果。双标准曲线法是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因,并用目的基因和管家基因的标准品分别作出标准曲线,处理与未处理样品同时扩增目的基因和管家基因,获得ct值,然后从各自的标准曲线上求出初始模板量,经管家基因均一化处理后,求出目的基因的相对含量。定量的表达是相对于某个参照物的量而言的,因此相对定量的标准曲线就比较容易制备,对所用的标准品不需要知道绝对拷贝数,只要知道其相对稀释度即可。通常选用的管家基因有gapdh、β-actin、β2-微球蛋白和rrna。此方法在扩增效率较低、目标基因与管家基因扩增效率有差异时适用,且需要很精确的结果计算。
如果反应条件控制较好,扩增效率较高,目的基因和管家基因的扩增效率基本一致,这时就不需要作标准曲线,而是通过与管家基因ct值之间的相差来计算目的基因的表达差异。比较ct法运用了数学公式来计算相对量,前提是假设每个循环增加1倍的产物量,根据数学推导得出:
在该公式中,δδct=(ct目的基因-ct管家基因)实验组-(ct目的基因-ct管家基因)对照组。因此,2-δδc t表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量,而不必制作标准曲线 荧光定量pcr技术实验条件的优化
定量pcr技术已经在生物学研究中得到了广泛的应用,技术也日臻完善,并且敏感度极高,特异性强;正因为敏感度高,很容易受其他因素的影响,因此要得到准确可靠的反应结果,必须根据不同的反应类型优化实验条件,如特异性探针及引物的设计、选择合适的mg2+浓度、引物和探针浓度、循环数等,规范操作步骤,并仔细配制pcr反应体系。
一是设计要求。引物设计是实时定量pcr中最重要的一步,扩增片段长度根据技术的不同有所区别:sybr greeni技术要求扩增片段不大于500 bp,taq man探针技术要求扩增片段长度在50~150 bp。引物序列选取应在基因的保守区段并具有特异性,长度一般为18~24 bp,避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,引物自身不能形成环状发卡结构,熔解温度tm值在55~65 ℃,gc含量在40%～60%,上、下游引物之间的tm值相差不要超过4 ℃。在taqman探针的设计上要求绝对保守,长度为30~45 bp,tm值在68~70 ℃,探针的5’端不能为g和避免多个碱基同时出现,探针应尽可能靠近上游引物。二是浓度。引物和探针的浓度也会影响反应的特异性,引物浓度太低会致使反应不完全,引物浓度太高会导致非特异性产物扩增。最佳的引物浓度一般在0.1~0.6 μmol/l,探针的浓度在0.05~0.30 μmol/l,可以在这个基础上再进一步优化,以达到引物探针整体的最佳浓度。三是稳定性。一般从生物技术定制引物是以干粉形式运输的,使用时最好用te溶液溶解,使其最终浓度为100 μmol/l,-20 ℃保存。纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高,且保存时间可以长达1年以上。由于反复冻融易导致探针降解,在确认探针质量好的情况下,最好稀释成2 μmol/l(10×),作为工作浓度分装多支,避光保存。四是退火温度。退火温度一般设定比引物的tm值低5℃。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火;同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度一般为55~70 ℃。
模板的质量会影响pcr扩增的效率。模板应在-20 ℃保存,避免反复冻融。用te溶液溶解和稀释模板,这能大大延长保质期。模板浓度应根据ct值选择,使ct值位于15～30个循环比较合适,若ct值大于30,则应提高的模板浓度;如果小于15,则应降低的模板浓度。
mg2+是影响taq酶活性的关键因素。mg2+的浓度过高,会增加非特异性扩增,降低忠实性;mg2+的浓度过低影响taq酶发挥最佳活性。一般来说,对以dna或cdna为模板的pcr反应,应选择2~5 mmol/l浓度的mg2+。
一般的实时定量pcr反应只需25～30个循环便可获得满意的结果,但是对于那些极微量的待测样本而言,适当增加循环数可以提高反应的检出底限,建议循环数为40个,但是并非循环数增加的越多,其敏感性就会越高。实际上,当循环数增加到某一值时,敏感性便不再升高。
定量实验,误差是不可避免的,设立重复实验,对数据进行统计处理,可以将误差降低到最小,因此定量实验的每个样本至少要重复3次以上。为了增加pcr扩增反应的可信度,在扩增的同时,需进行阴性、阳性对照反应。阴性反应中不加模板dna,而以水或缓冲液代替,用于检验是否存在pcr污染。阳性对照则用于检验pcr试剂和实验操作上可能出现的问题。相对来说,仪器、pcr 试剂、sybr greenⅰ染料是很稳定的,而操作和模板是薄弱环节,模板的加入量一定要准确,为确保实验数据的有效性,每个样品至少平行做3次重复。使用微量移液器时,如果不仔细,就会产生较大的用量误差甚至错误。在实验过程中应当避免室温下混合各种试剂,应在冰上进行,避免所配体系产生气泡,并且在一经混合后立即开始进行扩增。
通过设计针对目的基因的特异性引物和探针,并优化反应体系和控制反应条件,可以成功地建立快速、灵敏、特异的荧光定量pcr检测方法,实现大样本同时检测,节省大量的时间和反应成本。随着基因科学技术的发展,荧光定量pcr技术将会深入和拓展,在现代农业中得到更广泛的应用。
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