14次 摘要：为了给鲤鱼遗传资源保护及利用提供较为准确的基础数据,利用10对微卫星标记分析了黄河鲤(Huanghe Cyprinus carpio,人工养殖群体)、长江野鲤(Changjiang wild Cyprinus carpio,安徽段)、安徽养殖鲤(Anhui cultured Cyprinus carpio,宿州市)群体遗传多样 --> 　　摘要：为了给鲤鱼遗传资源保护及利用提供较为准确的基础数据,利用10对微卫星标记分析了黄河鲤(Huanghe Cyprinus carpio,人工养殖群体)、长江野鲤(Changjiang wild Cyprinus carpio,安徽段)、安徽养殖鲤(Anhui cultured Cyprinus carpio,宿州市)群体遗传多样性。遗传多样性分析实验表明:3个群体均具有较高的遗传水平,且长江野鲤群体遗传多样性高于黄河鲤、安徽养殖鲤;卡方检验表明:3个群体在较大程度上受到人类活动及生态环境变化的影响,30个位点中76.67%的位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡。遗传距离、遗传相似度、非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)聚类树及贝叶斯聚类分析均显示,长江野鲤与安徽养殖鲤亲缘关系较近,研究情况与实际生产中养殖户从长江里获得鲤鱼亲本用于繁殖苗种的现象相符。突变-漂移平衡分析显示,在TPM模式下,Wilcoxon符号秩次检验中黄河鲤群体显著偏离突变-漂移平衡,需进一步扩大选育群体。总体来说,黄河鲤、长江野鲤、安徽养殖鲤群体遗传多样性均较高,具有进一步的选育空间。　　关键词：鲤; 遗传多样性; 微卫星;　　鲤(Cyprinus carpio)属硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、鲤亚科，广泛分布于中国长江、淮河、黄河等淡水水域。中国鲤养殖历史悠久，在渔业生产中占有极其重要的地位。鲤由于地理分布不同，且经过长期的自然和人工选择，发生种群差别。近年来，由于人类活动的影响及盲目的开发利用，天然野生鲤的栖息生境、群体结构遭到严重破坏，资源量锐减，种质纯度降低。通过对鲤鱼群体遗传多样性和遗传结构的研究，揭示种质资源的遗传特性与进化规律，在生产上进行分子标记辅助育种，可以有效地保护鲤鱼的种质资源(李建林等,2012;李盛文等,2014;鲁翠云等,2016;桑滨等,2017)。　　微卫星DNA又称为短串联重复序列，是广泛分布于真核生物中的一种重复序列。Beckmann等(1990)建立的以PCR技术为基础的微卫星标记技术被广泛应用于动植物的遗传多样性分析(Weber and May,1989;Weber,1990)。微卫星标记是一种共显性遗传标记，每个标记位点存在几种等位基因，在不同的个体及群体间等位基因组合变异较大，因而具有丰富的多态性信息。微卫星DNA的多态性是由核心序列不同的重复次数及程度引起的，在鉴定亲缘关系近的群体时效率较高(孙效文等,2008)。　　微卫星标记具有不易受外界环境影响、易检测、高多态性、共显性、重复性高、结果可靠的优点，可用于鲤群体遗传学、种质鉴定等研究(刘伟等,2012;王新华等,2016;史君洁等,2018)。该研究以微卫星分子标记技术为实验手段，分析黄河鲤(Huanghe Cyprinus carpio,人工养殖群体)、长江野鲤(Changjiang wild Cyprinus carpio,安徽段)、安徽养殖鲤(Anhui cultured Cyprinus carpio,宿州市)3个鲤鱼群体的遗传多样性，探讨鲤鱼种质现状，为鲤鱼的保种、育种及新品种创制提供基础数据。　　1 结果与分析　　1.1 鲤鱼群体遗传多样性分析　　对10个微卫星位点在黄河鲤、长江野鲤、安徽养殖鲤3个群体中的扩增结果分析其遗传多样性参数(表1)。Na为2～8个，均值4.5;Ne在1.314 8～5.113 6之间，均值2.548 9;Ho在0.200 0～1.000 0之间，均值0.681 1;He在0.243 5～0.818 1之间，均值0.580 0;PIC在0.222 5～0.780 7之间，均值0.505 5。　　黄河鲤、长江野鲤、安徽养殖鲤3群体的平均Na分别为3.8、4.9、4.7；平均Ne分别为2.576 8、2.706 4、2.363 6；平均Ho分别为0.770 0、0.706 7、0.566 7；平均He分别为0.591 4、0.603 2、0.545 3;PIC分别为0.500 7、0.528 7、0.487 0。长江野鲤群体平均Ne略高于黄河鲤和安徽养殖鲤群体，说明相对于长江野鲤，黄河鲤和安徽养殖鲤群体遗传多样性有所下降。3个鲤鱼群体平均PIC表明黄河鲤、长江野鲤群体较安徽养殖鲤群体具有更高的遗传多态性。　　1.2 鲤鱼群体遗传结构分析　　3个群体间的Nei's遗传距离(DA)在0.097 2～0.147 4之间，相似系数(I)在0.862 9～0.907 4之间(表2)，遗传分化指数(FST)在0.048 8～0.083 2之间，基因流在2.755 9～4.873 0之间(表3)。AMOVA分析显示，6.14%遗传变异来自群体间，93.86%遗传变异来自群体个体间的遗传分化。基于群体间遗传距离(DA)构建的UPGMA聚类树(图1)显示，黄河鲤群体单独聚类，长江野鲤、安徽养殖鲤两个群体聚为一类。STRUCTURE群体遗传结构分析表明，K=2时拟然值最大，推断所有个体来自2个理论群(图2)，其中黄河鲤群体遗传结构相对独立，仅存在一定程度的混杂；而长江野鲤与安徽养殖鲤鱼混杂明显，群体间保持着较近的亲缘关系。　　1.3 鲤鱼群体Hardy-Weinberg平衡检验　　30个位点(3鲤鱼群体×10微卫星位点)HardyWeinberg平衡检验(表4)。30个位点中，有7个位点符合Hardy-Weinberg平衡(p>0.05)，占总数的23.33%，剩余23个位点检验为显著偏离(p<0.05)，占总数的76.67%。30个位点中，10个位点D>0，表现为杂合子过剩，其余20个位点表现为D<0，杂合子缺失。3群体30个位点中，大部分的位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡及杂合子缺失大于杂合子过剩，可见3群体在较大程度上受到人工选择压力及生境变化的影响。　　1.4 鲤鱼群体瓶颈效应分析　　鲤鱼3群体10个位点在IAM、TPM和SMM 3种突变模型假设下的遗传参数不同(表5)。在IAM假设下，除MFW059位点外，其它位点HE>HEQ，各位点差异不显著。在TPM假设下，HLJ系列标记位点HE>HEQ,MFW系列标记位点HE<HEQ,MFW059标记位点差异显著(p<0.05)。在SMM假设下，除HLJ058、HLJ379、HLJ393位点HE>HED，其它位点HE<HEQ,MFW050位点差异显著(p<0.05),MFW059位点差异极显著(p<0.01)。在IAM、TPM和SMM模式下，大多数位点差异不显著，因此3群体近期未出现瓶颈效应，群体数量均未下降。　　表2 3个鲤鱼群体间Nei's遗传相似系数(I,对角线上)和遗传距离(DA,对角线下)　　　　表3 3个鲤鱼群体间F-统计值(FST,对角线下)和基因流(Nm,对角线上)　　　　图1 基于DA遗传距离构建的UPGMA聚类树分析　　　　　　Figure 1 UPGMA clustering tree based on DAgenetic distance　　图2 3个鲤鱼群体在K=2值下的遗传结构分析注:1:黄河鲤;2:长江野鲤;3:安徽养殖鲤;两种颜色:两个不同的遗传组群　　　　Figure 2 Genetic structure assumed in K=2 for three Cyprinus carpio populations　　1.5 鲤鱼群体突变-漂移平衡分析　　分析鲤鱼3群体符号检验及Wilcoxon符号秩次检验结果(表6)。IAM模式下，黄河鲤、长江野鲤、安徽养殖鲤群体均表现出杂合过度，符号检验和Wilcoxon符号秩次检验中，仅黄河鲤群体极显著偏离突变-漂移平衡。TPM模式下，安徽养殖鲤群体杂合不足，而黄河鲤、长江野鲤群体显示杂合过度，符号检验中3群体均不显著偏离突变-漂移平衡，但黄河鲤群体在Wilcoxon符号秩次检验中显著偏离突变-漂移平衡。SMM模式下，黄河鲤群体处于突变-漂移平衡状态，长江野鲤、安徽养殖鲤群体显现杂合不足，其中安徽养殖鲤群体在符号检验和Wilcoxon符号秩次检验中极显著偏离突变-漂移平衡。3群体突变-漂移平衡分析反映了黄河鲤群体和安徽养殖鲤群体部分位点已经偏离了突变-漂移平衡，需进一步扩大选育群体。　　2 讨论　　2.1 鲤鱼群体遗传多样性分析　　群体遗传多样性是生物分化和进化的基础，遗传变异的程度决定了生物适应环境的能力。等位基因数、杂合度、群体多态信息含量越高的生物对环境的适应能力更强，在生长、繁殖、抗逆等方面也越具有优势(Beardmore et al.,1997)。Ne可反映基因之间的相互影响程度。该研究中长江野鲤群体平均Ne略高于黄河鲤和安徽养殖鲤群体，说明相对于长江野鲤，黄河鲤和安徽养殖鲤群体遗传多样性有所下降，可能与黄河鲤、安徽养殖鲤群体是经过选育的群体有关(关建义等,2010;马秀英等,2016)。　　表4 χ2检验概率值(p)与遗传偏离指数(D)　　　　表5 3个鲤鱼群体微卫星位点瓶颈效应分析　　　　平均杂合度高低可反映群体多样性程度。该研究中3个鲤鱼群体的平均杂合度均大于0.5，具有较高的遗传水平，均未受到高强度的选择。安徽养殖鲤因采用群体选育，且选择压力不够强大，从而也保持着较高的杂合度。平均PIC是衡量等位基因片段多态性的理想指标。黄河鲤、长江野鲤群体平均PIC>0.5，分别为0.500 7、0.528 7，为高度多态性；安徽养殖鲤群体平均PIC为0.487 0，为中度多态性，表明黄河鲤、长江野鲤群体较安徽养殖鲤群体具有更高的遗传多态性。在安徽养殖鲤群体累代繁殖中，由于人工选择的压力，导致了多态性下降。综上分析，该研究的3个鲤鱼群体均表现出丰富的遗传多样性，种源状况佳，可进一步选育。　　表6 3个鲤鱼群体突变-漂移平衡分析　　　　2.2 鲤鱼群体间遗传结构分析　　FST可反映群体间遗传分化程度。该研究显示，黄河鲤与长江野鲤群体间的遗传分化指数FST<0.05，群体间遗传分化程度较低；黄河鲤与安徽养殖鲤、长江野鲤与安徽养殖鲤群体间的遗传分化指数0.05<FST<0.1，属于中等程度的分化。可见，安徽养殖鲤群体由于人工压力选择及苗种的运输、迁徙，出现中等程度的遗传分化。Nm是反映群体遗传分化的一个重要因素。该研究中两两群体间Nm>1，说明3个鲤鱼群体不会由于遗传漂变而引起种群间的分化。黄河鲤与长江野鲤之间Nm最高，为4.873 0，两群体之间存在一定的基因流动，但因为存在品种间的隔离，基因流动并不频繁。AMOVA分析显示，3群体遗传变异主要来自群体内部的个体间，这可能与各群体长期处在各自的水域环境，生存环境相对隔离有关。　　群体间遗传距离越小，群体间的分化时间就越短，相似系数就越大(Crawford and Littlejohn,1998)。黄河鲤、长江野鲤、安徽养殖鲤群体属于同种群体间不同来源的群体，DA在0.097 2～0.147 4之间，I在0.862 9～0.907 4之间，遗传距离与相似系数范围与文献研究结果相一致，数据较可靠(Thorpe,1982)。其中黄河鲤与安徽养殖鲤群体间的DA和I分别为0.147 4、0.862 9，遗传距离最大，相似系数最低，说明2个群体来自不同的水体；而长江野鲤与安徽养殖鲤群体间的DA和I分别为0.097 2、0.907 4，遗传距离最小，相似系数最大，说明2群体可能来自同一水体。　　UPGMA聚类树显示，黄河鲤群体位于单独的一个进化分支，长江野鲤、安徽养殖鲤群体聚为一类。STRUCTURE研究也表明，当K=2时，黄河鲤群体具有相对独立的遗传结构，与其他群体缺乏足够交流；而长江野鲤与安徽养殖鲤鱼基因交流频繁，可能来自同一个理论群体，该研究结果与UPGMA分析结果相一致。自古以来，沿江渔民就从长江里收集鲤鱼苗种，培育成亲本，再进行人工扩繁，以上聚类结果与安徽养殖鲤群体亲本来源于长江野鲤群体的现实结果相符。　　2.3 鲤鱼群体动态平衡分析　　Hardy-Weinberg平衡时，各位点上的基因频率处于遗传平衡状态。该研究显示，3群体30个位点中，大部分的位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡，处于不平衡或极不平衡状态。长江野鲤部分标记位点偏离Hardy-Weinberg平衡，可能是由于人类活动，破坏了长江野鲤原始的生境，影响了基因平衡。而对黄河鲤和安徽养殖鲤来说，可能是由于人工选择压力、依靠表型选择亲本及可供选育的亲本有限出现创造者效应(何金钊等,2017)。杂合子缺失可能与种群内交、稀有等位基因缺失等原因有关(董秋芬等,2007)。对3群体的研究表明，30个位点中杂合子缺失大于杂合子过剩，这可能与人类对环境的影响及人工选择压力相关。其中黄河鲤、安徽养殖鲤杂合度缺失率大于长江野鲤，推测与引种群体小且长期的近交繁殖有关。　　DI Rienzo等(1994)研究表明，TPM进化模式较SMM模式、IAM模式更适用于微卫星数据分析，可应用于群体数量瓶颈效应评估。在TPM假设下，10个微卫星位点中，HE>HEQ和HE<HEQ标记位点各占5个，大多数位点差异不显著。因此，3个鲤鱼群体近期未出现瓶颈效应，群体数量均未下降。　　种群处于突变-漂移平衡，各位点杂合过度与不足的概率大致相等。在TPM假设下，符号检验中3个群体均不显著偏离突变-漂移平衡；Wilcoxon符号秩次检验中，黄河鲤群体显著偏离突变-漂移平衡。Wilcoxon符号秩次检验比符号检验的统计效率相对较高(Cornuet and Luikart,1996)。因此，该研究推测黄河鲤群体显著偏离突变-漂移平衡，其原因与其小种群繁衍缓慢、亲本数量有限有较大的关系，黄河鲤资源的保护亟需进一步加强。　　2.4 结论分析　　采用微卫星标记对3个鲤鱼群体的分析表明，黄河鲤、长江野鲤仍保持着较高的遗传多样性，但也出现了杂合子缺失现象，应进一步加强种质资源的保护和利用；安徽养殖鲤由于亲本更替慢且长期的人工压力选择，多样性有所下降，在实际应用中应及时更新亲本，优化选育路线。　　3 材料与方法　　3.1 试验材料　　黄河鲤(Huanghe Cyprinus carpio)群体引种于河南黄河鲤鱼良种场；长江野鲤(Changjiang wild Cyprinus carpio)群体采自安徽长江段；安徽养殖鲤(Anhui cultured Cyprinus carpio)群体由安徽万水源水产养殖科技有限公司提供。每个群体随机取样30尾，剪取鳍条置于75%酒精中，-20℃保存待用。　　3.2 基因组DNA的提取　　采用TIANGEN公司的组织提取试剂盒(DP304)提取鲤鱼基因组DNA,DNA的完整性由0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。Q3000核酸分析仪测定浓度及纯度后，-20℃保存备用。　　3.3 微卫星引物　　该研究采用的10对微卫星引物序列(表7)，其中HLJ系列引物来自参考文献(侯宁等,2007),MFW系列引物来自参考文献(Tanck et al.,2001)，所有引物退火温度均为55℃，由生工生物工程(上海)股份有限公司提供引物合成服务。　　3.4 PCR扩增体系及程序　　PCR体系为20μL:10×PCR Buffer(Mg2+)2μL、Mg Cl2(25 mmol/L)1.2μL、d NTP(2.5 mmol/L)1.6μL、上下游引物(10μmol/L)各0.5μL、5 U/μL的Taq DNA酶0.1μL、DNA 1μL，补充ddH2O至20μL。反应程序：94℃变性4 min;30个循环的扩增反应：94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s;72℃延伸8 min。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物后，硝酸银染色，分析。　　3.5 数据统计与分析　　等位基因数(Na)、观测杂合度(Ho)、有效等位基因数(Ne)、期望杂合度(He)由软件PopGene(Yeh et al.,1999)计算，并采用马尔科夫链方法进行HardyWeinberg平衡检验。基于等位基因频率的多态信息含量(PIC)参考Botstein等(1980)的方法计算。采用软件Arlequin(Excoffier and Lischer,2010)计算群体间分化系数(FST)。利用STRUCTURE 2.3(Pritchard et al.2000)进行群体遗传结构分析，分析理论群体数。利用BOTTLENECK 3.4(Maruyama and Fuerst,1985)计算平均期望杂合度(HEQ)，并进行符号检验(Sign test)及Wilcoxon符号秩次检验(Wilcoxon sign rank test)分析。　　表7 鲤鱼微卫星引物序列　　　　参考文献　　[1]Beardmore J.A.,Mair G.C.,and Lewis R.I.,1997,Biodiversity in aquatic systems in relation to aquaculture,Aquacul.Res.,28(10):829-839　　[2]Beckmann J.S.,and Soller M.,1990,Toward a unified approach to genetic mapping of eukaryotes based on sequence tagged microsatellite sites,Nat.Biotechnol.,8(10):930-932　　[3]Botstein D.,White R.L.,Skolnick M.,and Davis R.W.,1980,Construction of a genetic 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