14次 摘要：目的 了解手足口病患者EV-A71、CV-A16与CV-A6三种肠道病毒咽拭子病毒载量与病毒分离结果之间的关系。方法 克隆含肠道病毒特异核酸片段质粒,使用real-time PCR建立标准曲线,记录阳性咽拭子CT值,计算EV-A71、CV-A16与CV-A6三种肠道病毒患者咽拭子病毒载 --> 　　摘要：目的 了解手足口病患者EV-A71、CV-A16与CV-A6三种肠道病毒咽拭子病毒载量与病毒分离结果之间的关系。方法 克隆含肠道病毒特异核酸片段质粒,使用real-time PCR建立标准曲线,记录阳性咽拭子CT值,计算EV-A71、CV-A16与CV-A6三种肠道病毒患者咽拭子病毒载量。使用人横纹肌瘤细胞分离培养这3种肠道病毒,比较病毒分离阳性和阴性咽拭子病毒载量间的差异。结果 3种肠道病毒分离阳性咽拭子CT值的平均值和中位数都小于29,明显低于分离阴性咽拭子。患者咽拭子中,EV-A71、CV-A16和CV-A6的每毫升病毒载量平均值分别为108.27、108.42和108.69,CV-A16与CV-A6分离阳性咽拭子病毒载量显著高于分离阴性咽拭子的病毒载量(P<0.05)。结论 手足口病患者咽拭子经real-time PCR检测后,选择CT值较低标本分离肠道病毒能提高病毒分离阳性率,从而为基层实验室常规工作节约人力物力成本。　　关键词：肠道病毒; EV-A71; CV-A16; CV-A6; 病毒载量; 病毒分离培养;　　手足口病是一种常见的儿童肠道传染病,多感染5岁以下幼儿,可由多种肠道病毒引起,自2008年全国范围内的手足口病疫情暴发以来,手足口病的感染率急剧上升,已经累计感染700多万人[1],2010-2012年,北京市累计报告11万多例手足口病患者[2]。由我国研发的EV-A71疫苗已于2016年上市,有报道显示,随着EV-A71疫苗的上市和各项防控措施的实施,手足口病并没有销声匿迹,病原谱出现了新的变化[3]。因此,继续开展手足口病病原体研究,有利于深入了解手足口病,为制定相应防控措施提供依据。　　real-time PCR和病毒分离培养是手足口病实验室检测的2种常用方法[4]。real-time PCR灵敏度高,并且能快速检测患者咽拭子内的病毒载量,是开展病原体监测的主要使用方法。病毒分离培养主要用于分离病毒毒株,以便进一步分析病毒流行及遗传变异情况,该方法用时较长,人力物力消耗较大[5]。开展手足口病监测及病原检测以来,基层疾病预防控制中心实验室积累了大量数据,挖掘这2种不同实验方法数据的关联性,探索咽拭子病毒载量与病毒分离阳性率间的关系,有助于提高病毒分离培养效率,节省实验室人力物力成本。　　1 材料与方法　　1.1 标准曲线建立　　使用引物5′-CCGGCCCCTGAATGCGGCTAATC-3′,5′-GAACATGTGAGCAAAAGGCCAGC-3′,扩增肠道病毒VP1特异性核酸片段(517 bp,50～566),由北京诺赛基因组研究中心有限公司克隆PMD18-T载体,制备质粒,质粒经测序验证特异核酸片段的存在。采用美国Invitrogen公司Qubit 2.0测定质粒浓度,按照以下公式计算质粒浓度:　　DNA模板浓度(拷贝/μl)=C×10−9×6.02×1023M×660　　式中,C为质粒DNA的质量浓度12.9 mg/L,M为质粒DNA的碱基对数3 209(空载体碱基对数+插入目的片段碱基对数,本试验pMD18-T为2 692 bp,插入目的片段为517 bp),6.02×1023为阿佛加德罗常数计算个数。　　连续10倍稀释质粒提取液,制备1～10-6倍梯度标准品,使用江苏硕世生物科技有限公司肠道病毒通用病毒核酸检测试剂盒检测。实时荧光定量PCR仪采用ABI公司ABI7500,使用7500fast system software软件,手动设定基线和阈值,自动生成标准曲线。扩增效率=10-1/斜率-1。　　1.2 标本及资料来源　　依据《手足口病诊疗指南(2018年版)》[6],以北京儿童医院为哨点医院,2015-2017年每年3-5月开展监测,选择发病 48 h 内手足口病患者,由接受统一培训专业人员采集患者咽拭子,咽拭子于4～8 ℃冷藏,24 h内送北京市西城区疾病预防控制中心检测,咽拭子检测后于-80 ℃保存。　　1.3 核酸检测与病毒载量测定　　吸取咽拭子液140 μl,使用德国QIAGEN公司QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒按照说明书提取RNA,80 μl洗脱提取产物。real-time PCR检测使用江苏硕世生物科技有限公司通用肠道病毒核酸检测试剂盒、EV-A71/CV-A16分型试剂盒和CV-A6试剂盒,每个体系上样5 μl。咽拭子先经通用肠道病毒核酸检测试剂盒检测,阳性者经EV-A71/CV-A16分型试剂盒和CV-A6试剂盒分型。经检测共收集轻症手足口病患者EV-A71阳性咽拭子63份,CV-A16阳性咽拭子63份,CV-A6阳性咽拭子68份,记录这些咽拭子通用肠道病毒核酸检测CT值,CT值代入标准曲线,计算扩增体系中DNA模板浓度,每毫升咽拭子病毒载量=扩增体系中DNA模板浓度×10 000×140/80。　　1.4 病毒分离　　选择指数生长期的RD细胞,将1.3选择的咽拭子悬液与RD细胞37 ℃作用 20 min 后,把染毒的细胞置于含5%CO2的恒温箱中,37 ℃培养7 d,连续接种3代。培养过程中观察细胞形态变化,若细胞染毒48 h后开始出现圆缩脱落,经real-time PCR方法确认,即为病毒分离阳性。　　1.5 统计学分析　　采用Excel 2007软件建立数据库,CT值采用均数、中位数、四分位数表示。用SPSS 17.0软件进行统计学分析,核酸载量比较采用对数转换后进行单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。　　2 结 果　　2.1 标准曲线的建立　　Y=-3.37logX+56.987 083, 决定系数R2为0.994,斜率为-3.371, 扩增效率E为98.0%。质粒标准品原液浓度为3.7×109 拷贝/μl。　　2.2 EV-A71、CV-A16和CV-A6病毒细胞分离阳性与阴性咽拭子CT值分布情况　　3种肠道病毒分离阳性咽拭子CT值的平均值和中位数都小于29,明显低于分离阴性咽拭子。CV-A6病毒分离阳性咽拭子CT值的平均值和中位数最小,分别为26.54和26.83,EV-A71病毒分离阳性咽拭子CT值的平均值和中位数最大,分别为28.53和28.69。EV-A71和CV-A16病毒分离阴性咽拭子CT值的平均值和中位数都大于30(表1)。　　表1 3种肠道病毒病毒分离阳性和阴性咽拭子CT值　　　　2.3 EV-A71、CV-A16和CV-A6病毒细胞分离阳性与阴性咽拭子病毒载量比较　　EV-A71、CV-A16和CV-A6病毒咽拭子每毫升病毒载量平均值分别为108.27、108.42和108.69,3种病毒咽拭子病毒载量差异无统计学意义(F=2.33,P=0.1)。3种病毒分离阳性咽拭子每毫升病毒载量的平均值分别为108.44、108.82和109.04,CV-A16与CV-A6分离阳性咽拭子病毒载量显著高于分离阴性咽拭子病毒载量(P<0.05),EV-A71分离阳性咽拭子与分离阴性咽拭子病毒载量比较,P=0.074(表2)。　　表2 3种肠道病毒细胞分离阳性与阴性咽拭子病毒载量比较　　　　2.4 3种病毒分离阳性咽拭子核酸载量比较　　EV-A71、CV-A16和CV-A6病毒细胞分离阳性咽拭子病毒载量差异有统计学意义(P=0.03),见表2。两两比较,EV-A71病毒分离阳性咽拭子核酸载量低于CV-A6(P=0.01),而CV-A16与CV-A6病毒分离阳性咽拭子核酸载量差异无统计学意义(P=0.39)。　　3 讨 论　　肠道病毒属于微小核糖核酸病毒科的肠道病毒属,目前已发现70多种型别,其中20多种型别可以引起手足口病,CV-A16和EV-A71最为常见[7-8]。有报道显示,近年来,手足口病病原谱发生了新的变化,CV-A6的感染率逐渐升高,在有些地区已成为引起手足口病的主要病原体[9]。另外,感染CV-A6的非典型手足口病病例也有报道[10]。手足口病的高患病率和病原体的多样性为手足口病防控工作带来了很大挑战。　　本研究发现,3种肠道病毒分离阳性咽拭子CT值的平均值和中位数都小于29,明显低于分离阴性咽拭子。CV-A16与CV-A6病毒分离阳性咽拭子病毒载量显著高于分离阴性咽拭子病毒载量,EV-A71病毒分离阳性咽拭子与分离阴性咽拭子病毒载量差异无统计学意义,这可能受到样本数量的影响。手足口病年平均发病率为(54～318)/10 万人,80%以上患者经real-time PCR方法检测阳性[11]。通过细胞培养分离病毒毒株是深入了解肠道病毒流行与变异情况的重要前提,但该方法实验周期较长,本研究结果显示手足口病患者咽拭子经real-time PCR检测后,选择CT值较小标本分离肠道病毒能提高病毒分离阳性率。　　另外,本研究给出了患者感染EV-A71、CV-A16和CV-A6后发病48 h内咽拭子病毒载量的平均值:108.27、108.42和108.69,高于黎梅花等[12]的报道,这可能是由于该报道中患者采样部位和核酸提取试剂盒与本研究不同引起。对3种病毒分离阳性咽拭子核酸载量比较发现,EV-A71病毒分离阳性咽拭子核酸载量低于CV-A6,而CV-A16与CV-A6病毒分离阳性咽拭子核酸载量差异无统计学意义,其具体原因仍需要深入研究。　　总之,本研究收集EV-A71、CV-A16和CV-A6病毒患者咽拭子,咽拭子经real-time PCR检测后分离培养肠道病毒,通过分析2种实验方法结果,为“选择CT值较小标本分离肠道病毒能提高病毒分离阳性率”这一推论提供了具体数据支持。　　参考文献　　[1]Koh WM,Bogich T,Siegel K,et al.The epidemiology of hand,foot and mouth disease in Asia:a systematic review and analysis[J].Pediatr Infect Dis J,2016,35(10):285-300．　　[2]Tian L,Liang FC,Xu MM,et al.Spatio-temporal analysis of the relationship between meteorological factors and handfoot-mouth disease in Beijing,China[J].BMC Infect Dis,2018,18:158．　　[3]Li J,Sun Y,Du YW,et al.Characterization of coxsackievirus A6-and enterovirus 71-associated hand,foot and mouth disease in Beijing,China,from 2013to 2015[J].Front Microbiol,2016,7:391．　　[4]Luo KW,Gao LD,Hu SX,et al.Hand,foot,and mouth disease in Hunan 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